Смирнова Е.Ю. АСМ-визуализация пероксидазы
12.09.2020, 21:01
АСМ-визуализация пероксидазы Смирнова Е.Ю. Студентка ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА им. К.И. Скрябина, E-mail: Seu.bauer7030@gmail.com Садовская Т.А. Научный руководитель: ст. преподаватель, к.б.н. кафедры химии имени профессоров С.И. Афонского, А.Г. Малахова в ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА им. К.И. Скрябина, tatana123@mail.ru, тел.: 8 (963) 770-66-79., г. Москва. Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия; АСМ-подложка; АСМ-изображение; фишинг; детекция; пероксидаза хрена. Актуальность В биохимии и молекулярной биологии на сегодняшний день существует множество традиционных методов выделения белков из растворов: с использованием хроматографических колонок, планарных чипов, суспензионных микрочипов. Эти методы применяются в комбинации с методами регистрации для высокочувствительного обнаружения белков в растворах. Чувствительность анализа определяется эффективностью концентрирования белков и чувствительностью регистрирующих систем. Одним из примеров широко используемой системы для анализа белков является комбинация электрофореза с масс-спектрометрическим анализом (МС-анализом). Эта система позволяет детектировать белки в концентрации 10-12 - 10-13 М. Традиционные клинические системы медицинской диагностики основаны на использовании иммуноферментных методов анализа (ИФА) для обнаружения белков. Однако, чувствительность ИФА составляет порядка 10-12 М, что недостаточно для детекции белков в растворах с низкими и ультранизкими концентрациями (5). Разрабатываются новые аналитические микро- и нанотехнологические системы, которые в комбинации с методом фишинга (адсорбции белка на носителе) позволяют достичь высокой чувствительности. Показана возможность обнаружения белка в растворах при 10-18 М, а при использовании меток чувствительность доходит до 10-20 М. Возможность применения АСМ - фишинга для обнаружения белков, показана на примере селективного вылавливания белка из 10-16 М раствора (2, 4, 10). В настоящее время наблюдается большой интерес к исследованию единичных молекул ферментов, их свойств и активности, что легло в основу развития нового направления в биохимии – энзимологии единичных молекул, и обусловило актуальность развития новых методов их анализа. Изучение функционирования единичных молекул ферментов имеет преимущества перед традиционными методами определения активности ферментов. Главная положительная сторона заключается в получении информации о распределении молекулярных свойств отдельных биомолекул, а не об усредненных величинах. Появляется возможность, например, напрямую наблюдать за стадиями фолдинга белка, наличие которых в стандартных методах только предполагается, или наблюдать за работой единичных ферментов на различных стадиях биохимических реакций (4). Также следует отметить, что наблюдение за ферментной системой на уровне единичных молекул позволяет избежать влияния концентрационных факторов на результаты исследований. Например, некоторые биологические молекулы могут коагулировать при высоких концентрациях, тогда как работа с малыми концентрациями или с единичными иммобилизованными молекулами позволяет следить за свойствами мономеров и олигомеров (2, 4, 5). Этот метод предоставляет принципиальную возможность визуализировать и определять физико-химические свойства отдельных молекул. Субнанометровое вертикальное разрешение этого метода позволяет с высокой точностью определять высоту белка с минимальным воздействием на него со стороны АСМ-зонда. Таким образом, АСМ можно использовать для визуализации белков, определения высот белковых молекул и, соответственно, определения их олигомерного состояния, а также для мониторинга конформационной динамики фермента в процессе ферментативной реакции. Наибольшее количество исследований по данной теме относятся к антителам, как наиболее доступным из больших белковых молекул. Деление белковых молекул на крупные и небольшие произведено потому, что для первых разрешающая способность AСМ потенциально позволяет определить топографию поверхности, а порой и даже отдельных субъединиц, что позволяет говорить об их уверенной идентификации данным методом. Для небольших молекул возможно лишь определить наличие или отсутствие белка на подложке, не получая никакой информации о топографии поверхности молекулы (7, 9, 10). В данной работе исследовали адсорбцию на АСМ - подложке пероксидаза хрена (1.11.1.7). Свойства этого белка достаточно изучены и хорошо известны, что позволяет использовать его в качестве модельного белка. Пероксидаза (изофермент С) была использована как модельный фермент в различных целях: для создания биосенсоров, иммунологических тестов, как маркер гистологических исследований, в генной терапии и органическом синтезе (1,8). Данная изоформа фермента характеризуется изоэлектрической точкой РI=9 и проявляет максимальную активность при pH = 6-8. Молекулярная масса около 44 кДа. Углеводная часть фермента составляет 18 – 22 %, выполняет функцию защиты от протеолиза и модификации полипептидной цепи под действием свободных радикалов (8). Материалы и методы Оборудование: атомно-силовой микроскоп ACM NTEGRA (NT_MDT, Зеленоград), использовали программы: WSxM, Nova, FremtoScan Online to analyze, SPM images, tapping mode методика АСМ. В качестве АСМ-подложки была использована свежесколотая слюда (SPI, США), которая обладает атомарно ровной поверхностью и достаточно проста в использовании. Слюдяная подложка является гидрофильной, поэтому во избежание растекания капли использовали слюду, на которой с помощью акриламидного лака был сформирован гидрофобный бортик. Реактивы: деионизованная вода была получена на установке МиллиQ Симплиcити (Миллипор, Франция). Раствор пероксидазы хрена был приготовлен из лиофилизированного порошка (Reanal, Венгрия) без дополнительной очистки с помощью разведения в деионизованной воде. Приготовление образцов с адсорбированным белком: раствор пероксидазы (1 мкл из маточного раствора: 1мкМ пероксидазы в 100 мкл деионизованной воды) инкубировался на поверхности свежесколотой слюды в течение 10 мин; далее подложка однократно ополаскивалась деионизованной водой (1 мл) и высушивалась (10). Цели и задачи Цель исследования – визуализация отдельных молекул фермента пероксидазы с использованием атомно-силовой микроскопии. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. В качестве контрольного эксперимента была проведена визуализация поверхности после инкубации деионизованной воды. 2. АСМ-визуализация иммобилизованного фермента, растворенного в деионизированной воде, определение его олигомерного состояния. Результаты исследований Визуализация пероксидазы проводилась после ее фишинга на поверхность свежесколотой слюды. В качестве контрольного эксперимента была проведена визуализация поверхности после инкубации деионизованной воды. После того, как вода прошла через систему на установке МиллиQ Симплиcити, она наносилась на поверхность слюды в объеме 10 мкл. После этого инкубировали 10 минут при комнатной температуре, после чего встряхивали на центрифуге и высушивали на воздухе. Изображение контрольного эксперимента приведено на рисунке 1. На приведенном изображении видно, что на поверхности слюды не обнаружены объекты с высотой более 0,3 нм. Таким образом, вода является чистой и составляющие воды для приготовления раствора пероксидазы не вносят свой вклад в результаты АСМ-измерений (т.е. в воде нет артефактов: частичек пыли и др.) Рисунок 1. Пример полученного АСМ - изображения поверхности свежесколотой слюды после нанесения на нее деионизованной воды Пример полученного АСМ - изображения поверхности слюды после инкубации 10-9 М раствора пероксидазы представлен на рисунке 2. Распределение молекул представлено на рисунке 3. а) б) Рисунок 2. Пример полученного АСМ-изображения поверхности (а) свежесколотой слюды после инкубации 10-9 М раствора пероксидазы и сечение (б) участка, выделенного на рисунке (а) маркерной линией. Рисунок 3. Распределение визуализированных объектов по высотам. Как видно из рис. 3, наибольшее количество частиц имеет высоту 1,8 нм. В результате эксперимента наблюдалась сорбция отдельных молекул фермента с образованием мономолекулярного слоя белка. Белки - мономеры имеют высоту до 2,7 нм, высота белков - олигомеров больше 3,5 нм (4). Следовательно, пероксидаза была адсорбирована в мономерной форме, т.е. молекулы фермента в своем составе имели по одной полипептидной цепи. По литературным данным, эта полипептидная цепь состоит из 308 аминокислотных остатков. Образует 13 - α спиралей и 3 - β складки. Правильная конформация молекулы поддерживается четырьмя дисульфидными связями (8). Суммарный заряд ионизированных групп остатков аминокислот пероксидазы в деионизованной воде - положительный. В системе АСМ - фишинга в качестве подложки использовалась слюда. Слюдяная подложка имеет суммарный отрицательный заряд, поэтому наличие электростатического притяжения приводит к адсорбции молекул пероксидазы. Выводы Пероксидаза была адсорбирована в виде мономерного белка. Адсорбция пероксидазы была возможна за счет сил электростатического притяжения белка и подложки. Библиографический список 1. Алпеева И.С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе: дис. ... канд. хим. наук: 02.00.15 и 03.00.23 / Алпеева Инна Сергеевна. - М., 2007. - 136 с. 2. АСМ технологии как путь к обратному числу Авогадро / Т.О. Плешакова, И.Д. Шумов, Ю.Д. Иванов. // Биомедицинская химия, 2015. – Т. 61.- Вып. 2.- С. 239-253. 3. АСН-нанотехнологии для визуализации, счета, определения упругости и активности единичных белков цитохром P450-содержащих монооксигеназных систем / Ю. Д. Иванов, Н.С. Бухарина, П.А. Французов, Т.О. Плешакова и др. // Нанотехнологии и охрана здоровья, 2010. - Т.1. - Вып. 2. - С. 30-35. 4. Бухарина Н.С. Визуализация и мониторинг активности цитохрома P450 BM3 с использованием атомно-силовой микроскопии: дис. ... канд. хим. наук: 03.01.04 / Бухарина Наталия Сергеевна. - М., 2014. - 176 с. 5. Высокочувствительная детекция белков с помощью комбинации МС- анализа и АСМ- фишинга с индуцированием заряда. / Ю.Д. Иванов, Т.О. Плешакова, К.А. Мальсагова и др. // Биомедицинская химия, 2014. - №6. - С. 49-58. 6. Занавескин М.Л. Атомно-силовая микроскопия в исследовании шероховатости наноструктуированных поверхностей: дис. ... канд. хим. наук: 01.04.07 / Занавескин Максим Леонидович. - М., 2008. - 182 с. 7. КНИ- нанопроволочный транзистор для детекции молекул D-NFATc1 / Ю.Д. Иванов, Т.О. Плешакова, А.Ф. Козлов и др. // Автометрия, 2013. - №5. - С. 119-126. 8. Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств химической модификацией белковой глобулы и гема / Г.С. Захарова, И.В. Упоров, В.И. Тишков // Успехи биологической химии, 2011. - Т.51. - С.37-47. 9. Толстова А.П. Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования: дис. ... канд. хим. наук: 03.01.02 / Толстова Анна Павловна. - М., 2015. - 188 с. 10. Шумов И.Д. Использованием атомно-силовой микроскопии для определения белков в сверхнизких концентрациях: дис. ... канд. хим. наук: 03.01.04 / Шумов Иван Дмитриевич. - М., 2013. - 196 с.
Категория: Smart Student Science — 2020
Просмотров: 13 | Загрузок: 0 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
avatar